Но в системе CRISPR-Cas9 был и еще один компонент, выполняющий принципиально важную функцию – или, как оказалось, даже две функции. Его назвали “трансактивирующей CRISPR-РНК”, или tracгРНК. Запомните эту крошечную молекулу, ведь она сыграет несоразмерную роль в нашей истории. Дело в том, что наука обычно продвигается вперед не большими скачками, а маленькими шагами. И многие споры в науке сводятся к тому, кто сделал каждый из этих шагов и насколько каждый из них оказался важен. Именно так получилось с открытиями, связанными с tracгРНК.

Как выяснилось, tracгРНК выполняет две важные задачи. Во-первых, она инициирует создание cгРНК, то есть той последовательности, в которой содержится воспоминание о вирусе, ранее атаковавшем бактерию. Во-вторых, она служит рукояткой, с помощью которой происходит прикрепление к атакующему вирусу, чтобы cгРНК могла найти нужное место, где ферменту Cas9 предстоит сделать разрез.

Изучение этих функций tracгРНК началось в 2010 году, когда Шарпантье заметила, что молекула регулярно появляется в ее экспериментах с бактериями. Ее функция оставалась загадкой, но Шарпантье обратила внимание, что молекула находится в непосредственной близости от спейсеров CRISPR, и предположила, что между ними есть связь. Она проверила эту гипотезу, удалив tracгРНК в некоторых бактериях. В результате в них перестали появляться cгРНК. Ученые тогда еще не знали, как именно cгРНК создаются в бактериальной клетке. Теперь у Шарпантье появилась гипотеза: за создание коротких cгРНК отвечала tracгРНК.

В то время Шарпантье переезжала в Швецию. Когда исследователи из венской лаборатории прислали ей письмо с результатами наблюдений и сообщили, что в отсутствие tracгРНК не производится cгРНК, она потратила целую ночь на составление длинного плана дальнейших экспериментов. “Я зациклилась на этой tracгРНК, – говорит она. – Я упряма. Мне важно доводить дела до конца. Я сказала: «Мы должны пойти дальше! Я хочу, чтобы кто-нибудь занялся этим»”[133].

Проблема заключалась в том, что в ее венской лаборатории ни у кого не было ни времени, ни желания изучать tracгРНК. С этим часто сталкиваются странствующие профессора: стоит им покинуть своих студентов, как те двигаются дальше и начинают заниматься другими вещами.

Шарпантье подумывала провести эксперименты сама, хотя ее переезд и был в разгаре, но в конце концов нашла добровольца в своей венской лаборатории: ею стала юная болгарская студентка магистерской программы Елица Делчева. “Елица была очень активной и верила в меня, – говорит Шарпантье. – Она понимала, что происходит, хотя еще не получила и магистерской степени”. Она даже привлекла к работе одного из аспирантов, Кшиштофа Хылинского.

Маленькая команда Шарпантье обнаружила, что система CRISPR-Cas9 осуществляет свою миссию по защите от вирусов, задействуя всего три компонента: tracгРНК, cгРНК и фермент Cas9. Сначала tracгРНК разбивает длинные фрагменты РНК на малые cгРНК, а затем эти cгРНК направляются к конкретным последовательностям в геноме атакующего вируса. Ученые написали статью, которая в марте 2011 года была опубликована в журнале Nature: Делчева в ней значилась главным автором, а имена аспирантов, отказавшихся помогать Шарпантье, в историю не вошли[134].

Шарпантье представила результаты на посвященной CRISPR конференции, прошедшей в октябре 2010 года в Нидерландах. Редакторы Nature не спешили принимать статью, а объявлять об открытии до публикации было рискованно. И все же Шарпантье предположила, что среди слушателей может оказаться тот из рецензентов журнала, кто убедит редколлегию ускорить процесс.

Во время выступления она волновалась, поскольку еще не установила, что происходит с tracгРНК после создания cгРНК. Ограничивается ли этим ее роль? Или же две малые РНК вместе направляют белок Cas, который затем разрезает атакующий вирус? Один из слушателей задал прямой вопрос: “Остаются ли три элемента вместе, образуя комплекс?” Шарпантье попыталась уйти от ответа. “Я смеялась и намеренно говорила загадками”, – признается она.

Этот вопрос – и то, что было известно Шарпантье, – может показаться запутанным. Однако он привел к серии диспутов, которые показывают, что исследователи CRISPR – и в частности, Даудна – очень трепетно относятся к тому, чтобы знать, кому именно мы обязаны каждым маленьким прорывом. Тот факт, что tracгРНК действительно никуда не исчезает и играет важную роль в разрезании, позже войдет в число открытий, опубликованных в исторической статье 2012 года, написанной Шарпантье в соавторстве с Даудной. Однако, к досаде Даудны, по прошествии нескольких лет Шарпантье порой будет намекать, что ей было известно об этом еще в 2011 году.

Когда я надавил на нее, Шарпантье признала, что в ее статье 2011 года, опубликованной в Nature, роль tracгРНК не была описана целиком: “Мне казалось очевидным, что tracгРНК должна оставаться с cгРНК, но некоторых деталей мы еще не понимали в полной мере и потому не стали писать об этом в статье”. Она решила, что опишет функцию tracгРНК тогда, когда найдет убедительный способ доказать свои выкладки экспериментальным путем.

Она изучала систему CRISPR в живых клетках. Чтобы сделать следующий шаг, нужно было заручиться поддержкой биохимиков, которые смогут изолировать химические компоненты системы в отдельных пробирках и выяснить, как именно работает каждый из них. Именно поэтому Шарпантье хотела познакомиться с Даудной – та в марте 2011 года должна была выступить на конференции Американского общества микробиологии в Пуэрто-Рико. “Я знала, что мы обе там будем, – говорит она, – и решила, что обязательно найду возможность с ней поговорить”.

Когда на второй день конференции Дженнифер Даудна вошла в кафе при гостинице в Пуэрто-Рико, Эмманюэль Шарпантье сидела за столиком в углу – в одиночестве, как ей и нравилось, – и выглядела гораздо элегантнее других посетителей. Даудну сопровождал ее приятель Джон ван дер Ост, голландский исследователь CRISPR, который показал на Шарпантье и спросил, не хочет ли Даудна, чтобы он их познакомил. “Было бы здорово, – ответила Даудна. – Я читала ее статью”[135].

Шарпантье показалась Даудне очаровательной: ее отличали легкая стеснительность – возможно, притворная, – прекрасное чувство юмора и несомненное обаяние. “Меня поразили ее напор и лукавый юмор, – говорит Даудна. – Она мне сразу понравилась”. Они поболтали несколько минут, а затем Шарпантье предложила встретиться для более серьезной беседы. “Я хотела предложить вам поработать вместе”, – сказала она.

На следующий день они встретились за обедом и затем прошлись по мощеным улицам Сан-Хуана. Когда речь зашла о Cas9, Шарпантье воодушевилась. “Нам нужно выяснить, как именно он работает, – заявила она. – Какой именно механизм он использует, чтобы разрезать ДНК?”

Шарпантье понравилось, что Даудна очень серьезна и внимательна к деталям. “Думаю, работать с вами будет интересно”, – сказала она. Даудне импонировало рвение Шарпантье. “Стоило ей сказать, что работать со мной будет интересно, как у меня по спине пробежал холодок”, – вспоминает она. Даудну соблазняло и то, что грядущая работа напоминала детективную историю, участие в которой придавало ее жизни смысл: она искала ключ к одной из главных загадок жизни.

Накануне отъезда в Пуэрто-Рико Даудна обсуждала карьерные планы с Мартином Йинеком, работающим в ее лаборатории постдоком, который изучал структуру Cas1 и Cas6. Йинек сомневался – как оказалось, совершенно зря, – что добьется успеха в науке, и подумывал стать редактором медицинского журнала. Но в конце концов он отказался от этого плана. “Пожалуй, я останусь у вас в лаборатории еще на год, – сказал он. – Что вы мне поручите?” Он подчеркнул, что больше всего ему хочется найти собственный проект, связанный с исследованиями CRISPR.

Выслушав предложение Шарпантье, Даудна сочла, что такой проект идеально подойдет для Йинека. “У меня есть замечательный биохимик, который также разбирается в структурной биологии”, – сказала она Шарпантье[136]. Они решили связать Йинека с постдоком из лаборатории Шарпантье, работавшим над ее более ранней статьей о Cas9, Кшиштофом Хылинским, специалистом по молекулярной биологии из Польши, который остался в Вене, когда Шарпантье переехала в Умео. Вместе эти четверо сделали одно из главных открытий в современной науке.

Эмманюэль Шарпантье, Дженнифер Даудна, Мартин Йинек и Кшиштоф Хылинский в Беркли, 2012 г.

Глава 17. CRISPR-Cas9