Родился будущий святой 19 июля 1759 года в городе Курске, в благочестивой и состоятельной семье. В крещении он получил имя Прохор. Отец его, Исидор Иванович Мошнин (или, в написании того времени, Машнин), владел кирпичными заводами и в качестве подрядчика занимался строительством каменных церквей. Мать, Агафия Фатеевна, еще более своего мужа отличалась благочестием и благотворительностью и во всем помогала ему. У Прохора имелись также сестра Параскева и брат Алексей — оба старше его (соответственно на восемь и шесть лет).

На третьем году жизни Прохор лишился отца. Незадолго до смерти Исидор Мошнин взялся за строительство по чертежу знаменитого зодчего Растрелли каменного храма во имя преподобного Сергия Радонежского. Когда нижняя церковь храма с престолом во имя святого Сергия была завершена, он тяжело заболел. Перед смертью Исидор Иванович передал все свое состояние супруге и завещал ей завершить строительство церкви, что и было впоследствии исполнено Агафией Фатеевной. Она одна воспитывала сына в благочестии и в любви к молитве и храму Божию.

Еще в детстве над святым отроком не раз проявлялся дивный покров Божий, явно показывавший в нем избранника Божия. Когда ему исполнилось семь лет, мать, осматривавшая не завершенную еще Сергиеву церковь, взяла его с собой на самый верх строившейся колокольни. По неосторожности мальчик упал с колокольни на землю. Агафия в ужасе сбежала вниз, думая, что сын ее разбился до смерти, но, к неописуемой радости, нашла его целым и невредимым. Три года спустя мальчик тяжело заболел, так что домашние уже отчаялись за его жизнь. В это время в сонном видении Прохор увидел Пресвятую Богородицу, обещавшую ему Свое посещение и скорое исцеление от болезни. И в скором времени слова Пресвятой сбылись. В Курске случился ежегодный крестный ход с чудотворной иконой Знамения Пресвятой Богородицы (именуемой «Коренной»); на этот раз по причине дождя и грязи крестный ход прошел прямо через двор Агафии Мошниной. Агафия поспешила вынести больного сына и приложила его к чудотворной иконе, после чего отрок стал поправляться и вскоре совершенно выздоровел.

На десятом году жизни Прохора начали обучать грамоте. Он обнаружил светлый ум, хорошую память, но более всего полюбил чтение Священного писания и других душеполезных книг. Старший брат, Алексей, занявшийся торговлей, постепенно стал приучать к ней и Прохора. Однако отрок не питал любви к этому занятию; по выражению автора его Жития, «душа его стремилась стяжать себе духовное сокровище, нетленное и неоскудеваемое». Он и дня не пропускал без посещения церкви: раньше всех в доме ему приходилось вставать, чтобы поспеть на утреню, и лишь затем отрок отправлялся помогать брату.

В Курске святой любил разговаривать с неким юродивым, который вел благочестивую и уединенную жизнь. (В свое время этот юродивый предсказал матери Прохора великую будущность ее сына.) Прохор также желал стать иноком. Он поделился своей мыслью с матерью, и та не стала противиться, чувствуя, что сей удел уготован ее сыну.

В августе 1776 года Прохор отправился паломником в Киев, в знаменитую Киево-Печерскую лавру, откуда началось монашество в Русской земле. Недалеко от Лавры, в Китаевской пустыни, жил знаменитый затворник старец схимонах Досифей (в действительности старица, в миру Дарья Тяпкина). Прозорливый старец предугадал в юноше будущего великого подвижника Христова и прямо указал ему отправиться в Саровскую пустынь: «Гряди, чадо Божие, и пребудь в Саровской обители; место сие будет тебе во спасение; с помощью Божией там окончишь ты и свое земное странствование». При этом старец Досифей научил Серафима «умному деланию» — непрестанному повторению Иисусовой молитвы. По преданию, эта встреча состоялась за несколько дней до кончины старца Досифея, в сентябре 1776 года.

Прохор вернулся в Курск. По просьбе матери он провел здесь еще два года, как бы окончательно прощаясь со своими мирскими заботами и ведя уже вполне иноческую жизнь. Затем он навсегда простился с матерью. Та благословила его и вручила медный крест, с которым святой потом не расставался до конца своих дней. 20 ноября 1778 года, накануне праздника Введения во храм Пресвятой Богородицы, Прохор Мошнин явился в Саров, чтобы связать с этой обителью всю свою жизнь.

Обитель эта находилась на реке Саровке (отсюда название), при впадении ее в реку Сатис, на месте прежнего татарского города Сараклыч, в 37 верстах от города Темникова, в пределах Тамбовской губернии. Основана она была в 1706 году иеросхимонахом Иоанном и отличалась исключительным подвижничеством населявших ее иноков и строгостью устава.

Строитель (игумен) пустыни, старец Пахомий (кстати, родом тоже из Курска), «инок кроткий и смиренномудрый, много подвизавшийся в посте и молитве и бывший образцом иноков» (слова Жития), принял его в число послушников и отдал под начало иеромонаха Иосифа, бывшего казначеем Саровской обители. Прохор с ревностью исполнял все монастырские правила и уставы и нес различные послушания: в хлебне, в просфорне, столярне. Столярное дело очень хорошо давалось ему, и первое время его даже звали в обители «Прохор-столяр». Позже он был поставлен будильщиком обители: Прохор должен был раньше всех подниматься и будить братию на церковную службу.

Преподобный старался ни минуты не проводить в праздности, но постоянной работой предохранял себя от скуки, которую считал одним из опаснейших искушений. «Болезнь сия врачуется, — говорил он впоследствии, основываясь на собственном опыте, — молитвою, воздержанием от празднословия, посильным рукоделием, чтением слова Божия и терпением, потому что и рождается она от малодушия, беспечности и празднословия».

В 1780 году Прохор тяжело заболел: все тело его распухло, и он претерпевал жестокие боли; полагали, что у него водянка. Болезнь длилась три года, полтора года Прохор неподвижно лежал в постели, не имея возможности двинуть рукой или ногой. Врача не было, и болезнь не поддавалась лечению. Братия, которые сильно полюбили юношу, всеми силами старались помочь ему; старец Иосиф лично прислуживал ему, настоятель обители старец Пахомий также все время навещал больного. Наконец, настоятель решительно предложил Прохору позвать врача. Тот отказался, возложив все упование на Бога. По его просьбе старец Иосиф отслужил всенощное бдение и литургию о здравии юноши, на богослужении присутствовали все иноки обители. Затем Прохор исповедовался и причастился на своем одре Святых Таин. И вот, в момент самого причащения, ему явилась в видении Пресвятая Божия Матерь в сопровождении апостолов Иоанна Богослова и Петра. Обращаясь к Иоанну Богослову, Пречистая сказала, указывая перстом на Прохора: «Сей — нашего рода». Потом она возложила правую руку ему на голову, и тотчас в правом боку его открылась рана, из которой стала вытекать жидкость, причинявшая святому такие страдания. В скором времени он окончательно исцелился, и только следы раны всегда оставались на его теле как явственное напоминание сего дивного исцеления. Об этом чудесном видении старец Серафим впоследствии не раз рассказывал своим ученикам.

Спустя несколько лет на месте дивного явления Пречистой Божией Матери (то есть на месте кельи Прохора) была сооружена двухэтажная церковь с двумя престолами и при ней больница. По поручению настоятеля Прохор сам собирал пожертвования на ее строительство, причем побывал и на своей родине в Курске. Он уже не застал в живых мать; брат же его, Алексей, оказал щедрую помощь в деле строительства храма. Сам Прохор соорудил своими руками в нижней больничной церкви престол из кипарисового дерева. Престол этот был освящен 17 августа 1786 года (накануне пострижения Прохора) в честь преподобных Зосимы и Савватия Соловецких. До конца своих дней преподобный Серафим причащался Святых Таин преимущественно в этом больничном храме.