Каков же механизм?

Со временем коллеги начали открыто признавать, что за результатами наших исследований структуры ранних эмбрионов скрывается нечто важное. Однако у них возникали вопросы. В чем заключается механизм? Существуют ли ген или какие-то эпигенетические изменения, которые запускают процесс, влияющий на судьбу клеток в начале развития? Если да, можно ли их обнаружить?

Для проведения исследований по идентификации механизма мы нуждались в финансовой поддержке. Которую так и не получили. Всякий раз при подаче заявки на финансирование тот или иной анонимный рецензент отвечал, что у нас нет доказательств того, что клетки на такой ранней стадии отличаются друг от друга, следовательно, нет необходимости искать механизм. Трудно поверить, сколько заявок на грант было отклонено таким образом и сколько месяцев было впустую потрачено на их написание. Продвинуться вперед мы смогли только благодаря случайному открытию, автором которого была потсдокторский исследователь Мария-Елена Торрес-Падилья, присоединившаяся к моей группе после защиты диссертации в Институте Пастера в Париже.

В то время моя лаборатория соседствовала с лабораторией моего друга, выдающегося биолога-онколога Тони Кузаридеса, который открыл несколько эпигенетических модификаций гистоновых белков, помогающих упаковывать в хромосомы клеточную ДНК. Эти изменения влияют на то, какие гены будут считываться, и потенциально способны изменить клеточные характеристики. Под влиянием Тони (как косвенным, так и непосредственным) мы смогли установить важные эпигенетические различия между индивидуальными клетками эмбриона на четырехклеточной стадии.

Мария-Елена обнаружила разницу в метилировании двух специфических аргининовых (аргинин — это аминокислота, один из строительных блоков белка) остатков в гистоне H3 (типе гистоновых белков). Поначалу мы думали, что эта разница отражает различные фазы клеточного цикла, ведь клетки не делятся строго в такт. Но, к счастью для нас, эта разница оказалась действительно важной: наименьший уровень специфического метилирования присутствовал в клетке, которая, согласно нашим предыдущим результатам, была склонна дифференцироваться в трофэктодерму (формирующую плаценту, а не ребенка).

Но корреляция, какой бы идеальной она ни была, не подтверждает причинно-следственную связь. Чтобы убедиться, Мария-Елена ввела в одну из клеток двухклеточного эмбриона послание для фермента CARM1, прикрепляющего метальные группы к аргининовым остаткам на гистоне H3. Это единичное изменение сделало клетку более плюрипотентной, имеющей наивысший потенциал развития. Оно привело к повышенной экспрессии генов, кодирующих факторы плюрипотентности, — молекулярные переключатели SOX2 и NANOG, которые повышают способность клетки к дифференцировке. В результате клетка с повышенным уровнем CARM1 порождала клетки, превращающиеся в собственно эмбрион.

Это молекулярное переключение было просто поразительным. Наша работа предоставила первые сведения о механизме, склоняющем клетку эмбриона к дифференциации в трофэктодерму. Такая клетка обладала наименьшей активностью фермента CARM1. В 2007 году журнал Nature опубликовал наше открытие [21].

Исследование впервые приоткрыло молекулярный механизм, скрывающийся за неоднородностью мышиного эмбриона и нарушением его симметрии [22]. Оно показало, что клетки соревнуются за свою судьбу, а значит, некоторые клетки лучше других предрасположены к формированию собственно эмбриона, и это склоняет их на определенный путь развития. По чистой случайности статья была опубликована в тот самый день, когда в кембриджской больнице Рози родился мой сын Саймон. Это был еще один невероятно счастливый момент в моей жизни.

Истории одной клетки

Поскольку тогда меня заинтересовали другие темы, в моих поисках молекулярного механизма начального нарушения симметрии наступил многолетний перерыв. Однако несколько лет назад, когда у нас появилась возможность взглянуть на ранний эмбрион под новым и очень информативным углом, наш интерес к симметрии снова пробудился. Нас подстегнул успех коллег в области секвенирования нуклеиновых кислот, позволяющий прочитать все послания иРНК[14] индивидуальной клетки. Послания содержат инструкции по созданию белков, полученные от ДНК (клеточного хранилища генетической информации). Чтобы превратить код РНК-посланника в белок, клетка нанимает другой тип РНК — транспортную РНК, которая переносит строительные блоки белков, называемые аминокислотами. Зная о присутствии конкретных посланий, можно понять, какие гены в каждой клетке включаются и выключаются на ранних этапах жизни эмбриона.

В 2014 и 2015 годах сообщалось, что в целом генетические инструкции, переписанные с «рецептов» ДНК в послания РНК, различаются между клетками двухклеточного эмбриона [23]. Эти исследования подтвердили, что только одна из двух клеток действительно тотипотентна, то есть способна развиться в мышь, как впервые было показано в экспериментах Энн Макларен и Джинни Папайоану.

С помощью такой высокочувствительной методики мы могли выяснить, какие гены последовательно используются в клетках, склонных развиваться в собственно эмбрион, а какие — в клетках, формирующих трофэктодерму, а затем сравнить полученные данные. К тому времени Мария-Елена, занятая решением других задач, вынуждена была переехать в Германию в лабораторию в Мюнхене. Но у меня уже был новый аспирант, Мубин Гулам из Южной Африки, любознательный и, что важно, полный энтузиазма пересмотреть весь этот затянувшийся спорный вопрос.

Мубин помнит, как ему часами приходилось наблюдать за каждым отдельным эмбрионом, пока тот дробился поздно ночью, переходя от двухклеточной стадии к четырехклеточной. Затем надо было изолировать каждую клетку. И если бы хоть одна оказалась повреждена, «пришлось бы уничтожить весь эмбрион». Несмотря на трудности, это время ему запомнилось как захватывающее [24].

Нам снова предстояло много работы, требующей тщательного выполнения, наряду с экспериментами, которые могли продолжаться с вечера до следующего утра. По моей просьбе Мубину пришли на помощь два превосходных эмбриолога: Агнешка Едрусик родом из Польши и Сара Грэхем из Новой Зеландии, которые когда-то готовили диссертации на базе моей лаборатории, после чего остались в ней работать. Я же, со своей стороны, купила в офис кофеварку и диван, на котором можно было спать.

Вычислительным анализом данных занималась лучшая группа во всем Кембридже команда Джона Мариони из соседнего Европейского института биоинформатики и, в частности, Антонио Шиалдоне [25]. Анализируя каждую клетку четырехклеточного эмбриона, Антонио обнаружил множество генов, значительно отличающихся своей активностью. Их было слишком много для исследования. Ему пришла в голову гениальная мысль сосредоточиться лишь на тех, что были мишенями для двух ключевых и уже изученных факторов транскрипции, ОСТ4 и SOX2, регулирующих активность генов, критически важных для клеточной потентности и гибкости. Мы могли продемонстрировать разницу в паттернах активности таких генов.

Обнаружив множество генов-мишеней, мы для начала сфокусировались на одном, кодирующем транскрипционный фактор SOX21, и сделали это не без причины. Во-первых, фактор SOX21 использовался как раз на четырехклеточной стадии, а во-вторых, клетки на этой стадии производили его в разных количествах.

Для проверки функций SOX21 Мубин создавал эмбрионы, клетки которых обладали либо повышенным, либо пониженным уровнем этого фактора. Клетки с измененным уровнем SOX21 он промаркировал, чтобы иметь возможность проследить их судьбу. Оказалось, что SOX21 при дифференцировке в трофэктодерму регулирует экспрессию другого ключевого фактора транскрипции, CDX2. Именно ему посвящалась докторская диссертация Агнешки, и мы много знали о его роли благодаря работе как нашей, так и других научных команд [26].

Мубин обнаружил, что высокий уровень SOX21 склонял клетки развиваться в эпибласт, поскольку приводил к снижению уровня CDX2. И наоборот, низкий уровень SOX21 приводил к повышенной экспрессии CDX2, склоняя клетки на постройку трофэктодермы. Примечательно, что на уровень экспрессии SOX21 влияла активность фермента CARM1 — того самого, который мы раньше изучали с Марией-Еленой.