В процессе деликатных манипуляций под микроскопом Каролина сделала тревожное открытие: эти клетки порой вращались относительно второй клетки во время ее деления, из-за чего можно было перепутать полюса. Чтобы избежать ошибки, мы решили, что Каролина будет помечать флуоресцентной гранулой другой конец клетки (вегетативный полюс). Так можно было гарантировать правильную идентификацию каждой клетки на стадии четырехклеточного эмбриона. Под конец Каролина «раздевала» четырехклеточный эмбрион, разделяя его на составляющие клетки, а затем из каждой индивидуальной клетки (с общей историей) создавала химеру. Этот финальный шаг следовало выполнять в предрассветные часы, когда клетки достигали данной стадии развития. Как же хотелось сказать нашим эмбрионам: «Пожалуйста, развивайтесь чуть медленнее, чтобы я поспала подольше, а позже мы наверстаем упущенное». Увы, реальность была иной.
Работать приходилось тщательно и безостановочно, и это изматывало. Каждый эксперимент занимал день и ночь, требовал кропотливых действий со стопроцентной концентрацией, чтобы создать лишь несколько химер. И разумеется, для статистической достоверности мы были вынуждены все повторять. Каждый эксперимент по созданию всех анимальных, всех вегетативных или всех анимально-вегетативных химер требовал окрашивания и наблюдения сотен эмбрионов и создания многих химерных эмбрионов, чтобы получились надежные и весомые результаты. К пяти вечера мне надо было забирать Наташу из детского сада и отвозить домой, поэтому я оставляла Каролину и отправлялась в долгий путь.
Но однажды вечером кое-что произошло. У Каролины случился приступ ужасной головной боли, и мне пришлось самой продолжить эксперименты, хотя мои навыки слегка заржавели. Причиной боли была опухоль. Она разрослась так сильно, что потребовалась срочная операция. Хотя опухоль, к счастью, оказалась доброкачественной, она парализовала половину красивого лица Каролины, испортив ее теплую улыбку.
Несмотря на ужасное испытание, Каролина была полна решимости вернуться ко мне как можно скорее. Научные исследования были ее любимым делом. Сначала было сложно. Паралич затруднял работу Каролины; например, процесс всасывания эмбрионов через пипетку — ведь нужно было брать ртом открытый кончик стеклянного капилляра и с его помощью перемещать клетки между чашками Петри. Конусообразным кончиком капилляра крошечные эмбрионы выхватывались из питательной среды за счет пониженного давления воздуха, создаваемого (да-да) всасывающим движением и небольшим вдохом. Это требует ловкости. Чтобы выпустить драгоценный груз из пипетки, надо нежным выдохом увеличить давление. Для этого Каролине пришлось не просто улучшить мелкую моторику, а... развить заново.
В целом мы повторяли эти эксперименты на протяжении двух лет. Согласно догме об идентичности клеток, все эти разные химеры должны обладать одинаковым потенциалом превращения во взрослую мышь. Но мы с восхищением обнаружили, что это не так. Из всех разновидностей идеально развивались те, что были построены из двух типов клеток — только они были склонны превращаться в эмбрион. Вегетативные клетки (склонные генерировать клетки для формирования плаценты) в эмбрион вообще не развивались. Хотя эти клетки принимали участие в создании бластоцисты, в процессе индивидуального анализа мы обнаружили, что они генерировали меньше плюрипотентных (так называемых эпибластных) клеток, способных построить организм. Было ясно, что горстка клеток раннего эмбриона уже склонна к определенной судьбе.
Наши эксперименты с созданием химер из разных типов клеток были изящными и выразительными, или, по крайней мере, нам так казалось. Коллеги предположили, что мы представим результаты в авторитетный журнал — это внесло бы весомый вклад в разрешение дискуссии не только о наших предыдущих исследованиях, но и о работе Ричарда Гарднера. Каролина тоже об этом мечтала. Но учитывая консерватизм коллег, я предвидела неизбежную войну с анонимными рецензентами, поскольку эта статья еще сильнее рушила преобладающую догму о том, что в ранних эмбрионах млекопитающих нет никакого уклона, а значит, и никаких паттернов.
Чтобы еще больше усложнить нам процесс принятия решения, жизнь поманила Каролину новыми возможностями. За время проведения кембриджских исследований она вышла замуж и родила дочь. Ее мужу предложили работу в США, и ей, разумеется, хотелось быть рядом с ним. Я ее полностью в этом поддерживала. Мы были непобедимой научной командой, и мне требовалось время, чтобы найти кого-то, кто был бы таким же талантливым и увлеченным и в то же время простым и теплым, движимым не одними лишь карьерными устремлениями.
Зная о скором отъезде Каролины, мы представили работу с химерами в журнал
К 2005 году у нас было открытие в области нарушения симметрии, которое опиралось на огромный объем работ. Чтобы убедиться, что место проникновения сперматозоида действительно играло важную роль, мы экспериментировали с партенотами (неоплодотворенными яйцеклетками, которые можно заставить начать развитие с помощью электрошока или дозы химикатов). Мы отследили судьбу многих тысяч эмбриональных клеток. Мы создавали сотни и сотни химер, пытаясь раскрыть детали влияния на эмбрион экваториального и меридионального клеточного деления [16].
Например, Каролина обнаружила, что если обе клетки на двухклеточной стадии делятся экваториально, то большинство эмбрионов после имплантации не развиваются [17]. Приятно, что через несколько лет это наблюдение подтвердилось исследованиями на человеческих эмбрионах, развивающих так называемую сплюснутую форму.
Джон Гёрдон тайком от меня сказал соавтору данной книги Роджеру Хайфилду, что мое с Каролиной исследование хотя и спорное, однако заслуживает статьи в
Ради этой статьи Роджер обратился за комментарием к пионеру технологии экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) Роберту Эдвардсу. Тот рассказал, как сам собирал косвенные доказательства того, что клетки эмбриона могут приобретать индивидуальность гораздо раньше, чем предполагалось, и высказал подозрение, что у человеческих эмбрионов может быть то же самое. Для клинической практики это имело огромное значение. Согласно методике предимплантационной генетической диагностики (ПГД), после ЭКО генетические и хромосомные нарушения диагностируются путем извлечения клеток из раннего эмбриона. Эдвардс вместе с другими исследователями был обеспокоен тем, что извлечение «неправильных» клеток на этой стадии может нарушить способность эмбриона к развитию. Безусловно, наши химерные эксперименты невозможно повторить на сотнях человеческих эмбрионов, а значит, нельзя быть абсолютно уверенным, применимы ли наши результаты к человеку. Многие клиники ЭКО делают ПГД и не обрадуются такому утверждению. Я чувствовала, что не стоит увлекаться подозрениями Роберта Эдвардса, не собрав дополнительных доказательств.
Лучше один раз увидеть
В то время я была полностью уверена, что будущий успех кроется в наращивании наших съемочных усилий, от документальных короткометражек до чего-нибудь в стиле постановки Кшиштофа Кесьлёвского «Декалог: десять заповедей». Когда я приступила к тому, что считала огромным шагом вперед, я была беременна, на этот раз Саймоном, хотя еще не знала об этом.
Чтобы сделать такой шаг, мне пришлось подать заявку на финансирование; требовалось приобрести специальное оборудование — микроскоп Zeiss и светочувствительную (и дорогую) камеру Hamamatsu для съемки эмбрионов крупным планом, способную захватывать срезы через столько последовательных плоскостей (с такой чувствительной камерой не надо было направлять на эмбрионы слишком много света и беспокоить их). Наши кинозвезды-эмбрионы действительно сияли, ведь мы использовали генетически измененных мышей, клеточные ядра которых флуоресцировали во время производства GFP. Этот флуоресцентный сигнал имел решающее значение, поскольку помогал шаг за шагом отслеживать жизнь каждой отдельной клетки, и мы всегда могли определить, кто есть кто, даже когда клетки перемещались. Развитие мышиных (и человеческих) эмбрионов очень пластично, поэтому любое возмущение может сдвинуть эмбрион на совсем другую онтогенетическую траекторию. Чтобы установить для эмбрионов, находящихся под ежедневным наблюдением, постоянные условия среды, надо было снабдить микроскоп инкубатором, поддерживающим температуру 37 °С, как в теле матери. Полагаю, в этом плане наш режиссерский стиль был более реалистичным, скорее, в духе Джеймса Марша с его «Человеком на канате», чем Кесьлёвского. Наконец, нам требовалась съемочная команда.
Мне повезло отыскать двух фантастических людей. Одним из них был мой новый аспирант Эмлин Парфитт, другим — постдок Маркус Бишофф, временно перешедший к нам из команды Питера Лоренса. Маркус трудился «в две смены», часть времени посвящая эмбрионам плодовых мушек дрозофил и часть времени — работе со мной, подобно тому, как я сама в период постдокторских исследований разрывалась между мышиными и лягушачьими эмбрионами Мартина Эванса и лабораторией Джона Гёрдона. Получившиеся таймлапсы точно отслеживали окончательное местонахождение каждой клетки на двух-, четырех- и восьмиклеточных стадиях развития. Фильмы показывали судьбу клеток на протяжении нескольких дней, включавших несколько клеточных делений на стадии бластоцисты — полого шарика из клеток, почти готового к имплантации в матку.
В отличие от предыдущих работ, мы пользовались не только глазами и мозгом, но и специальным программным обеспечением для отслеживания клеток. Что было важно, поскольку исключало любую предвзятость, даже неосознанную, при оценке судьбы индивидуальных клеток, когда мы анализировали наши фильмы. Это также сильно облегчало слежение за отдельными клетками. Анализ выполнялся Маркусом и Эмлином, которые независимо друг от друга оценивали каждый эмбрион и положение каждой клетки.
Это было огромное командное усилие, Маркус с Эмлином полностью вложились в проект. Для меня это означало воплощение долгожданной мечты, и мне не терпелось узнать, что они обнаружили. Сама я не могла помочь с анализом данных, поскольку моя вторая беременность оказалась не такой легкой, как первая.
Точные трехмерные фильмы выявили множество важных деталей развития от момента, когда эмбрион состоит всего из двух клеток, до превращения в бластоцисту. Яркие флуоресцентные следы подтвердили все наши предыдущие результаты. Они поддержали идею о том, что одна клетка двухклеточного эмбриона склонна развиваться в эмбриональную часть бластоцисты, из которой формируется собственно эмбрион, а вторая склонна генерировать внеэмбриональные ткани. Они показали, что этот уклон зависит от ориентации и порядка деления, начиная с двухклеточной и заканчивая четырехклеточной стадией, и влияет на последующие паттерны клеточного деления. Мы считали, что это потрясающее исследование, и представили наши документальные фильмы вместе с подробным анализом в
Они были отправлены на рецензию, но пока мы подготавливали наш манускрипт к публикации, в журнале