Деятельность преподобного Иосифа вышла далеко за рамки основанной им обители. Его с полным правом можно назвать одним из самых влиятельных людей в России конца XV — начала XVI века. Едва ли не более всего Иосиф Волоцкий известен в русской истории своей борьбой с ересью, распространившейся в конце XV века в Новгороде, а затем и в Москве и получившей название «ереси жидовствующих». По словам самого Иосифа, ересь эта была завезена в Новгород неким иудеем Схарией (Захарией), который увлек в свою веру некоторых из новгородских священников: впоследствии от них научились другие, и так ересь распространилась сначала в Новгороде, а затем, вместе с переехавшими новгородцами, и в Москве. Причем ее приверженцами стали не только, и даже не столько рядовые священники, сколько многие иерархи Церкви и люди из окружения самого великого князя Ивана III. Впрочем, современные исследователи ставят под сомнение взгляды Иосифа на истоки появления ереси в Новгороде, считая «жидовина» Схарию личностью более мифической, нежели реальной. Название же свое ересь получила из-за приверженности новгородских и московских еретиков к неканонической литературе, в том числе и иудейской (переведенной с древнееврейского языка), а также астрологии и каббалистике. (Первоначально это, по-видимому, было вызвано спорами по поводу приближающегося «конца света», которого ожидали в 1492 году, 7000-м по принятому в то время счету лет от «Сотворения мира»; в подобной литературе новгородские вольнодумцы искали опровержения общепринятых расчетов.) Но так или иначе, а сторонники ереси, действительно, вскоре (после присоединения Новгорода к Москве и массовых переселений новгородцев) заняли многие важные посты в церковной иерархии. Сторонником ереси был видный дипломат и государственный деятель дьяк Федор Курицын; благосклонно относилась к еретикам-вольнодумцам невестка великого князя Ивана III Елена Волошанка (вдова его покойного сына Ивана Ивановича Молодого); да и сам великий князь, как полагают, до определенного времени благоволил еретикам. Тайным еретиком называли и митрополита Зосиму Брадатого, занимавшего кафедру в 1490–1494 годах.

Борьбу с ересью «жидовствующих» начал новгородский архиепископ Геннадий, который вскоре привлек к ней и волоцкого игумена. (Волок в церковном отношении подчинялся Новгороду.) Иосиф выказал себя неукротимым и бескомпромиссным борцом за чистоту православия. Он пишет послания епископам, обличительные полемические сочинения против еретиков. Между 1492 и 1504 годами Иосиф в основных чертах завершает работу над главным трудом своей жизни — «Сказанием о новоявившейся ереси новгородских еретиков», получившем название «Просветитель». Еще в 1490 году ересь была осуждена церковным собором, но не разгромлена окончательно. Иосиф считает принятые меры совершенно не достаточными. Он не признает даже раскаяния еретиков, считая такое раскаяние лицемерным и требуя жестокого наказания — пожизненного отлучения от Церкви и заточения в темницу. В 1502 или 1503 году преподобный встречается с великим князем Иваном III, убеждая его в необходимости казней еретиков; при этом сам великий князь признается волоцкому игумену, что знал о ереси и потворствовал ей. Иосифа поддерживают и другие церковные иерархи. В 1504 году в Москве созывается новый церковный собор, на котором новгородские и московские еретики осуждены на казнь. В Москве и Новгороде запылали костры. «Тоя же зимы князь велики Иван Васильевич и сын его князь велики Василей Иванович всеа Русии со отцем своим Симоном митрополитом и с епископы и с всем собором обыскаша еретиков и повелеша лихих смертною казнью казнити. И сожгоша в клетке диака Волка Курицына (брата Федора Курицына. — Авт.), да Митю Коноплева, да Ивашка Максимова декабря 27, а Некрасу Рукавову повелеша языка урезати и в Новегороде Великом сожгоша его. И тое же зимы анхимандрита Касиана Юрьевского сожгоша и его брата, и иных многих еретиков сожгоша, а иных в заточенье заслаша, а иных по манастырем», — свидетельствует летописец. (Федор Курицын, против которого были направлены главные обвинения Иосифа, либо умер еще раньше, либо по какой-то причине избежал наказания.)

Житие святого Иосифа сообщает о том, что суровость преподобного по отношению к еретикам вызвала ропот недовольства среди многих епископов и старцев. До нас дошло «Слово об осуждении еретиков» Иосифа Волоцкого, включенное в расширенную редакцию его «Просветителя», где преподобный оправдывает казни приверженцев ереси ссылками на Священное писание и святоотеческую литературу. Особая роль в расправе над еретиками, по его словам, принадлежит великому князю. Иосиф показал себя решительным сторонником укрепления власти великого князя — сначала Ивана III, а затем его сына Василия III. (При том, что прежде он с осуждением отзывался об Иване, благоволившем еретикам.) Иосифа Волоцкого по праву считают одним из идеологов российского самодержавия. Ему принадлежит формула самодержавной власти православного государя: «Царь естеством подобен всем человеком, властью же подобен высшему Богу».

Преподобного Иосифа отличала суровость и нетерпимость не только по отношению к еретикам, но и по отношению ко всем своим противникам. Известны его столкновения по поводу церковного землевладения с преподобным Нилом Сорским. Иосиф считал возможным обвинять Нила едва ли не в ереси. Так, ему стало известно, что Нил, редактируя жития святых для своего трехтомного «Соборника», исключил некоторые, не внушившие ему доверия чудеса; следовательно, делал вывод Иосиф, заволжский старец не верит в чудотворцев. Впрочем, сомнения Иосифа вызвали резкую отповедь со стороны учеников Нила, в частности знаменитого старца Вассиана Патрикеева (в миру князя Василия Ивановича Косого).

Известно и столкновение Иосифа с новгородским архиепископом Серапионом (также причтенным к лику святых Русской Церковью). Причиной конфликта стал переход Иосифо-Волоколамского монастыря под покровительство великого князя Василия III, вызванный ссорой игумена с удельным князем Федором Борисовичем Волоцким. (Преподобный Иосиф жаловался на обиды, чинимые монастырю князем Федором: тот отбирал у монастыря деньги, не возвращал долги, а «старцев добрых хотел кнутием бити».) Переход этот состоялся без благословения новгородского архиепископа (под юрисдикцией которого находился монастырь) и даже вопреки его воле. Разгневанный Серапион наложил проклятие на Иосифа, отлучив его от Церкви. Преподобный обратился к защите митрополита и великого князя. Вопрос о новгородском архиепископе обсуждался на церковном соборе 1509 года: владыка был лишен сана, отправлен в заточение, а затем сослан в Троице-Сергиев монастырь, Иосиф же оправдан. Впоследствии между Иосифом и Серапионом произошло примирение.

Между тем преподобный достиг преклонных лет: ко времени созыва собора 1509 года ему было под семьдесят. Незадолго до своей смерти Иосиф, с согласия братии, назвал имя своего преемника на посту настоятеля волоколамской обители — им стал его ученик Даниил, впоследствии поставленный митрополитом Московским. Заботу же о монастыре преподобный поручил самодержцу и государю всей Русской земли великому князю Василию III.

К тому времени преподобный тяжело болел. Он сам возложил на себя схиму, причастился Святых Таин. Преподобный не мог даже сидеть, и братия носили его на службу и клали в церкви в особом, укрытом от посторонних взглядов месте, чтобы он мог слышать святую службу.

Преставился преподобный 9 сентября 1515 года, в 10-м часу ночи, когда братия пели в церкви. По свидетельству Жития, хоронил его пешношский игумен Вассиан, дядя преподобного Иосифа. Он же утешал осиротевших иноков, «хотя и сам не мог удержаться от рыданий и слез», по свидетельству агиографа. Погребен преподобный в своей обители, в соборной церкви Успения Пресвятой Богородицы, против алтаря.

Местное празднование преподобному Иосифу было установлено в 1578 году и подтверждено в 1589 году. Общецерковное же празднование установлено 1 июня 1591 года.

Церковь празднует память преподобного Иосифа Волоцкого в день его кончины, 9 (22) сентября.