После рокового взрыва в ходе начавшегося следствия Рысаков в своих показаниях называл «Техника» создателем разрывных снарядов. 17 (29) марта Кибальчича выследили в библиотеке на Невском проспекте и арестовали. Находясь в заключении, он продолжал инженерную работу. В частности, в тюрьме он создал проект реактивного воздухоплавательного прибора, что в эпоху паровых двигателей было смелым инженерным решением и шагом в будущее.

Так следователи определили шестерку подозреваемых в организации и совершении убийства императора: Николай Рысаков, Андрей Желябов, Софья Перовская, Геся Гельфман, Тимофей Михайлов, Николай Кибальчич. Интересно, что непосредственного убийцу, бросившего бомбу под ноги государя, умершего в тот же день, так и не удалось опознать. В материалах дела он фигурировал как «Котик», «Михаил Иванович» и «Ельников». Последняя фамилия стала известна следователям из подложного паспорта, по которому он проживал в столице. Имя убийцы раскрылось уже после суда по «делу первого марта». Им оказался Игнатий Якимович (Иоахимович) Гриневицкий, уроженец Минской губернии, польского происхождения. На момент покушения ему было 25 лет. Существуют свидетельства, что ввиду невозможности установления личности голову Гриневицкого будто бы заспиртовали и поместили в стеклянную банку для будущего опознания. Однако голова до наших дней не сохранилась, и эта история все больше кажется похожей на легенду.

Следствие по «делу первомартовцев» завершилось составлением обвинительного акта и было передано на рассмотрение Особого присутствия Правительствующего Сената, в ведении которого к тому времени находилось рассмотрение государственных преступлений. Судебное разбирательство было назначено на 26 марта (7 апреля). Дата оказалась под вопросом, когда 17 (29) марта полиция задержала Кибальчича. Однако допрос нового подозреваемого и иные необходимые формальности были выполнены быстро, что позволило следователям уже 21 марта (2 апреля) подготовить дополнительный обвинительный акт. К тому же, сам Кибальчич отказался от положенного семидневного срока на ознакомление с делом, вызов свидетелей и подготовку защиты и ходатайствовал о рассмотрении его дела совместно с делом остальных подсудимых.

Накануне дня суда Желябов подал заявление о своем несогласии с компетенцией Особого присутствия Сената. В заявлении он указал, что действия подсудимых «направлены исключительно против правительства», что «правительство, как сторона пострадавшая, должно быть признано заинтересованной в этом деле стороной и не может быть судьей в своем собственном деле». Подчеркивая неподсудность дела Особому присутствию, Желябов признавал единственной судьей в этом деле «весь русский народ чрез непосредственное голосование» или «в лице своих законных представителей в Учредительном собрании». Однако, признавая неосуществимость такой формы суда, он требовал рассмотрения дела судом присяжных, будучи «в глубокой уверенности, что суд общественной совести не только вынесет нам оправдательный приговор, как Вере Засулич, но и выразит нам признательность отечества за деятельность особенно полезную».

К слову сказать, такое требование не соответствовало действовавшему тогда законодательству. В компетенцию суда присяжных изначально не входили дела о государственных преступлениях, в том числе преступлениях против Особы Государя Императора. Поэтому заявление Желябова осталось без внимания.

Судебный процесс начался 26 марта (7 апреля) в 11 часов утра под председательством первоприсутствующего Особого присутствия Сената Э. Я. Фукса. Обвинение в процессе поддерживал исполняющий обязанности прокурора Санкт-Петербургской судебной палаты Н. В. Муравьев. Все шестеро «первомартовцев» обвинялись во вступлении в тайное общество, которое, как указано в обвинительном акте, имело цель «ниспровергнуть, посредством насильственного переворота, существующий в Империи государственный и общественный строй, причем преступная деятельность этого сообщества проявилась в ряде посягательств на жизнь Священной Особы Его Императорского Величества, убийстве и покушении на убийство должностных лиц и вооруженных сопротивлений властям». Они же обвинялись в «злом умысле и преступных действиях против жизни императора», наказание за которые предусматривалось статьями 241, 242, 243 и 249 Уложения о наказаниях в виде смертной казни.

Кроме того, Желябов был обвинен в организации покушения на царя 18 (30) ноября 1879 года, когда он на пути следования царского состава близ города Александровск заложил под железнодорожное полотно мину и не сумел осуществить покушение только из-за неисправности бомбы. Кибальчич также обвинялся в приготовлении покушения под Александровском и на Одесской железной дороге: он доставил Желябову необходимую для совершения взрыва спираль Румкорфа (индукционную катушку) и хранил в своей квартире материалы и отдельные части для производства бомб. Перовская дополнительно обвинялась в подготовке нападения, случившегося день спустя после событий под Александровском, когда заложенная в подкоп мина взорвалась под свитским поездом царского состава. Михайлов также обвинялся в оказании вооруженного сопротивления при задержании.

Защиту представляли видные присяжные поверенные (адвокаты) того времени: Е. И. Кедрин (Перовская), В. Н. Герард (Кибальчич), К. Ф. Хартулари (Михайлов), А. М. Унковский (Рысаков) и А. А. Герке (Гельфман). Желябов от адвоката отказался. Тактика защиты сводилась к тому, чтобы акцентировать внимание суда на смерти непосредственного убийцы императора и тем самым освободить своих подзащитных от подозрений в цареубийстве. Дополнительным аргументом в защиту Рысакова называлось его несовершеннолетие (на момент преступления ему было 19 лет, в то время как совершеннолетие считалось при достижении 21 года). Также особым подходом отличалась судебная защита Михайлова и Гельфман. Вывод об их вовлеченности в террористическую деятельность «Народной воли» основывался на показаниях Рысакова и косвенных свидетельствах, что могло породить у суда сомнения в достаточности собранных против них доказательств.

Все подсудимые, за исключением Рысакова, подтвердили свое участие в социал-революционной партии «Народная воля». Рысаков же это отрицал, указывая на свою приверженность скорее партии «Черный передел», которая, как и «Народная воля», образовалась после распада «Земли и воли», но, в отличие от народовольцев, не имела ярко выраженной террористической направленности. Так он пытался оградить себя от негативных последствий решения о причастности его к противозаконной деятельности «Народной воли». При этом, рассчитывая на смягчение наказания, Рысаков в ходе судебного процесса подтвердил данные им на следствии показания, в которых он изобличал других подсудимых в прямом или косвенном участии в событиях 1 марта 1881 года.

Судебные выступления Кибальчича и в особенности Желябова отличались от показаний других подсудимых. В лице суда они получили трибуну для провозглашения революционной программы партии и придания ей еще большей огласки. Кибальчич говорил о своем намерении следовать давним идеалам партии, стать ближе к простому народу, нести городскому и крестьянскому населению социалистические идеи и культурные идеалы. Желябов в судебных речах был более конкретен. Несмотря на требования первоприсутствующего говорить исключительно о личном отношении к партии, он рассказал о партийной структуре, «основанной на подчинении младших кружков старшим, сходящимся в центральный», об обстоятельствах принятия исполнительным комитетом партии решения ликвидировать царя, о деталях покушения на железной дороге под Александровском.

Далее слово предоставили государственному обвинителю Муравьеву. Его выступление, длившееся почти пять часов, отличалось натужной страстностью и чрезмерной напыщенностью. Речь прокурора содержала множество метафорических оборотов и ассоциаций: «из кровавого тумана, застилающего печальную святыню Екатерининского канала, выступают перед нами мрачные облики цареубийц», «медленно и печально опустился до половины флагшток, означающей высочайшее присутствие, императорский флаг на Зимнем дворце и русские люди поняли, что все кончилось», «когда люди плачут — Желябовы смеются» и другие. Виртуозно подбирая обстоятельства дела одно к другому, как элементы мозаики, Муравьев с позиций обвинения собрал общую картину происшедшего и привел описание роли каждого подсудимого в совершенном злодеянии. Так, Желябова он охарактеризовал как «типический конспиратор», а Рысакова назвал «слабохарактерным исполнителем». При этом, подчеркивая зависимость последнего от влияния более опытного революционера, он сравнил Желябова и Рысакова с учителем и учеником.

Перовскую Муравьев изобразил циничной и хладнокровной женщиной, действия которой недоступны здравому пониманию. Комментируя мягкую, тихую, обстоятельную речь Кибальчича, Муравьев заключил: «Мягко стелет, да жестко спать». Михайлов в выступлении прокурора предстал «грубым, неразвитым, малограмотным, едва умеющим подписать фамилию простым рабочим», который из революционного учения постиг только то, что «хорошо, если завод Вакферсона будет принадлежать ему в качестве пайщика или дольщика». Говоря о Гельфман, прокурор использовал выразительное слово из записки с описанием личностных характеристик подсудимой — ««неинтеллигентная» хозяйка конспиративной квартиры, которая, будучи таковой, исполняет «неинтеллигентные обязанности»».

В заключение своего долгого выступления Муравьев призвал суд вынести «безусловно обвинительный приговор» с назначением высшей меры наказания — смертной казни. По мысли прокурора, такое наказание позволит пресечь крамолу и вернет России спокойствие и мир. «С корнем вырвет русский народ адские плевелы русской земли и тесно, дружно сомкнувшись несчетными рядами благомыслящих граждан, бодро последует за своею несокрушимою, единою священной надеждой, за своим ныне вступившим на царство августейшим вождем», — высокопарно закончил Муравьев.

Затем первоприсутствующий предложил высказаться защитникам подсудимых. Адвокат Рысакова совместил в защитной речи все обстоятельства, которые бы могли смягчить вину подсудимого: то, что Рысаков «едва вышел из отроческого возраста, имеет за собой хорошее прошлое, известен своею хорошею нравственностью и был вовлечен в это преступление примером и убеждениями других лиц». Адвокаты Михайлова и Гельфман в своих выступлениях обращали внимание судей на преобладание косвенных доказательств виновности их подзащитных. По их мнению, такая доказательственная база не может служить основой для назначения сурового наказания. Защитник Кибальчича отметил, что прокурор в выступлении выдвинул один общий тезис: «…у всех обвиняемых одинаковая программа действий, одинаковые задачи, одинаковые мысли, одинаковые эмблемы, которые доказывают принадлежность их к социально-революционной партии…», однако прокурор ничего не мог сказать подобного о его подзащитном. По версии адвоката, фигура Кибальчича выбивалась из общего ряда обвиняемых по той причине, что он играл в цареубийстве опосредованную роль. Адвокат Перовской сделал акцент на событии, которое напрямую повлияло на неизбежную вовлеченность подсудимой в преступную деятельность. Летом 1878 года она сбежала из-под ареста по пути в ссылку и перешла на нелегальное положение. Постоянный страх быть пойманной невольно толкал ее в преступную среду.

Желябов отказался от защитника и поэтому выступал самостоятельно. В защитной речи он, насколько ему позволяли процессуальные правила и контроль первоприсутствующего, постарался оппонировать доводам прокурора, вспоминая историю революционного движения и уходя в пространные размышления о партийных целях и средствах борьбы. Князь Н. Н. Голицын и жандармский генерал Н. И. Шебеко так вспоминали поведение Желябова на следствии и суде:

«То был страшный Желябов, великий организатор новых покушений в местностях и условиях самых разнообразных и неслыханных. Он обладал удивительной силой деятельности и не принадлежал к числу дрожащих и молчащих. Невозможно допустить, чтобы хоть тень раскаяния коснулась его сердца в промежутке между организацией преступления и часом его искупления; на следствии и суде он выказал наибольшее присутствие духа и спокойное, рассудительное хладнокровие; он входил в малейшие детали и вступал в спор с судьями и прокурором…»