Как это часто бывает в науке, я начала с гипотезы. К моменту получения моего диагноза моя команда отследила судьбы достаточного количества эмбрионов, чтобы подкинуть мне идею о том, что между клетками эмбриона существует соревнование, где победителями становятся самые плюрипотентные клетки, которые и продолжают развиваться в плод, в то время как менее плюрипотентным достается та часть эмбриона, что превращается в плаценту. Возможно, нечто подобное происходит между нормальными и аномальными клетками, когда аномальные клетки преимущественно занимаются созданием плаценты, а не самого эмбриона, поскольку аномальные клетки могут быть менее плюрипотентными, чем нормальные. Разумеется, это была лишь гипотеза. Я была готова ко всему.
Зачастую обнаруженная наукой реальность гораздо интереснее любого воображения. Исследование покажет, что я ошибалась. Я мыслила в правильном направлении, но действительные подробности оказались иными — неожиданными и потрясающими.
Мозаики и химеры
Поскольку мы, разумеется, не могли проверить мою гипотезу на человеческих эмбрионах, мы использовали мышиные. Чтобы разобраться в воздействии аномальных клеток на мозаичный эмбрион, нам пришлось создать сотни мышиных эмбрионов и исследовать тысячи составляющих их клеток. Это огромное усилие требовало преданных своему делу ученых и соответствующего финансирования.
Пока я собиралась с мыслями, чтобы обдумать, как именно буду проверять эту гипотезу, я провела вслед за CVS еще один тест — амниоцентез, при котором мне опять под ультразвуковым контролем вводили иглу, на этот раз в амниотический мешок, окружавший моего развивающегося ребенка, чтобы взять на анализ небольшое количество прозрачной амниотической жидкости. Амниотическая жидкость, защищающая малыша, содержит фетальные клетки, по которым можно диагностировать хромосомные нарушения. Они не были обнаружены. Мы вздохнули с облегчением. И все же, пока я не взяла на руки своего новорожденного ребенка, я не могла полностью успокоиться.
Еще одна хорошая новость заключалась в том, что у меня теперь было достаточно средств для проведения исследований, помогающих объяснить результаты моих анализов. По итогам собеседования, проведенного в тот день, когда я узнала о своей беременности, фонд Wellcome Trust выдал стипендию для моих старших научных сотрудников. Денег, изначально предназначенных для другого проекта, было достаточно, чтобы немедленно направить их часть на моделирование мозаичных эмбрионов.
Я приступила к поискам нового члена команды, которого можно было вдохновить на эту работу.
По стечению обстоятельств у Хелен Болтон была степень по медицине и заявка на написание докторской диссертации под моим руководством, поданная тем летом. Мы несколько раз встретились, чтобы обсудить проект, и замысел ей понравился. Для поддержки ее обучения мы решили подать в Wellcome Trust заявку на дополнительное финансирование и были польщены ее одобрением, можно было расширять наши исследования.
Работы предстояло очень много. Для начала надо было найти надежный способ (в идеале — не один) создания аномальных клеток. Далее нам требовалось каким-то образом их пометить, чтобы отследить их судьбу, пока они будут развиваться среди нормальных клеток. Создать аномальные клетки оказалось намного труднее, чем изначально казалось. Хелен пробовала нарушить процесс сегрегации хромосом множеством разных способов, и в итоге мы остановились на препарате под названием реверсии, который уже использовали в нашей лаборатории для другого исследования.
Реверсии — это небольшая молекула-ингибитор. Мы хотели подавить с ее помощью ключевой процесс сегрегации хромосом, молекулярную контрольную точку, которая в норме приостанавливает деление клетки пополам (митоз) до тех пор, пока правильное количество ДНК-содержащих хромосом не распределится между двумя дочерними клетками. Реверсии блокирует активность фермента под названием «киназа монополярного веретена 1» (
Для демонстрации того факта, что реверсии и в самом деле вызывает хромосомные аномалии, мы проанализировали необработанные и обработанные реверсином эмбрионы, пометив три случайно выбранные хромосомы методом флуоресцентной гибридизации, или
Эффект обработки реверсином был преходящий, и как только Хелен вымывала препарат, контрольная точка сегрегации восстанавливалась. И это важно, поскольку мы могли ограничить присутствие хромосомных аномалий конкретным «окном» развития эмбриона.
Удостоверившись, что можем создавать аномальные клетки, мы решили узнать, могут ли обработанные реверсином эмбрионы вообще развиваться. Хелен обработала реверсином четырехклеточные эмбрионы и обнаружила, что через четыре дня они создали меньше клеток, чем необработанные эмбрионы. Но, несмотря на это, они по-прежнему сформировали три базовых типа клеточных линий.
Чтобы выяснить, могут ли обработанные реверсином эмбрионы превратиться в мышей, нам надо было подсадить их приемным матерям. Это происходило до того, как мы научились культивировать эмбрионы in vitro. И пока среди нормальных эмбрионов на каждые десять приходилось семь имплантированных, у обработанных реверсином эмбрионов данное соотношение было вдвое меньше. Важно отметить, что ни один обработанный реверсином эмбрион не смог превратиться в жизнеспособную мышь. Эти эксперименты показали, что, когда значительное количество клеток эмбриона имеет хромосомные аномалии, эмбрионы погибают, даже если им удается имплантироваться и какое-то время развиваться.
Теперь мы могли сосредоточиться на главном вопросе: как развивается эмбрион, если только часть его клеток имеет хромосомные аномалии? Чтобы ответить, нам надо было создать мозаичные эмбрионы, у которых аномальные клетки существовали вместе с нормальными, и мы решили провернуть это путем создания химер вроде тех, что делала Каролина (см. главу 5).
Мы не могли создать мозаичный эмбрион, поскольку не могли обработать реверсином лишь несколько клеток в пределах одного эмбриона, чтобы сделать их аномальными, и выбрали альтернативный подход, основанный на создании химер из клеток разных эмбрионов (мозаичный эмбрион развивается из одной оплодотворенной яйцеклетки). Химеры были предпочтительнее мозаичных эмбрионов, потому что позволяли планомерно выяснить, какое количество аномальных клеток нарушает процесс развития. К счастью, подход сработал.
Хелен обработала каждый эмбрион реверсином в момент перехода из двухклеточной стадии в четырехклеточную, а по достижении восьмиклеточной стадии разделила эмбрион на отдельные. Затем она смешала четыре клетки нормального эмбриона с четырьмя клетками обработанного реверсином и получила восьмиклеточный химерный эмбрион.
Чтобы отследить судьбу каждой клетки, нужно было найти маркер. Мы воспользовались линией мышей, созданных моими друзьями из Нью-Йорка, Кэт Хаджантонакис и Джинни Папайоану, с генетическими изменениями, способствующими экспрессии GFP в клеточном ядре [2]. Мы использовали эмбрионы этих мышей для того, чтобы обработанные и необработанные реверсином клетки были разного цвета — только так их можно было отличить. Клетки, экспрессирующие GFP, визуально демонстрировали точное время и место рождения новой клетки, ее последующие деления, а также время и место смерти, если клетка не выживала. Так мы могли нарисовать для каждой клетки целое «фамильное древо».
Мы снимали фильмы о судьбе индивидуальных клеток, как уже делали однажды, когда пытались понять, в какой момент клетки эмбриона склоняются на определенный путь развития (глава 4). Хелен наблюдала прямо на экране, как количество аномальных клеток уменьшалось преимущественно в той части эмбриона, которая генерировала ткани нового организма, то есть в эпибласте. Аномальные клетки умирали в процессе апоптоза — запрограммированной клеточной гибели. Частота апоптоза в той части эмбриона, которой суждено было стать собственно эмбрионом, была более чем в два раза выше среди обработанных реверсином клеток, чем среди контрольных, необработанных.
Эксперимент показал, что аномальные клетки в основном уничтожались в той части эмбриона, которая должна была превратиться в плод. Это подтверждало мою гипотезу о том, что аномальные клетки в этой части эмбриона проигрывают нормальным, хотя я не угадала сам механизм.